HEMATOLOGIA CLINICA
HEMATOLOGIA CLÍNICA. MFB1082. PUCGO.
ESCOLA DE CIÊNCIAS MÉDICAS E DA
VIDA.BIOMEDICINA
Prof. Luiz Murilo Martins de Araújo
www.profluizmurilo.med.br
e-mail:
[email protected] HEMOGLOBINAS –
ELETROFORESES E
OUTRAS METODOLOGIAS
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE
CATÓLICA DE GOIÁS
BIOMEDICINA
Prof.Luiz Murilo Martins de Araújo
HEMOLISADOS
• Os hemolisados para eletroforese de
hemoglobinas podem ser feitos por meio do
uso de saponina a 1% (100µL de sangue total
e 100µL de saponina) ou pelo tratamento com
clorofórmio. O uso de clorofórmio destrói a Hb
H e Hb Instáveis, porém é usado para a
dosagem de Hb Fetal.
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HEMOLISADOS
• Preparação do hemolisado com clorofórmio – a obtenção de
hemolisado entre 10 e 15g/dL de hemoglobina, tal qual o método
descrito a seguir, é importante para dosagem de Hb Fetal. Para
eletroforese qualitativa de hemoglobinas é aconselhável usar
hemolisados com concentrações de hemoglobina variáveis entre 4 a
6g/dL. A técnica de preparação de hemolisados consiste das
seguintes fases:
• 1. Centrifugar 1ml de sangue com anticoagulante a 1.500rpm,
durante 5 minutos; remover o plasma e lavar os eritrócitos por duas a
três vezes com solução salina a 0,85%. Centrifugar outra vez nas
mesmas condições e desprezar o sobrenadante.
2. Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar outro de água
destilada. Homogeneizar, e a seguir adicionar um volume de
clorofórmio, idêntico ao do hemolisado formado. Agitar
vigorosamente e centrifugar a 2.000rpm, por 15 minutos.
A solução de hemoglobina sobrenadante, ou hemolisado, é retirada
por meio de pipeta Pasteur e transferida para um frasco limpo. A
concentração do hemolisado, preparado conforme metodologia
apresentada, geralmente é variável entre 10 e 15g/dL.
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HEMOLISADOS
• Preparação de hemolisados rápidos – esse procedimento técnico
é recomendável para estudo populacional, nas suspeitas de
hemoglobinas instáveis e talassemia alfa. Não é aconselhável utilizá-
lo para dosagens bioquímicas de hemoglobinas, especialmente de
Hb Fetal.
- Reativo hemolisante
Saponina P.A. ....................... 1g
Água destilada ...................... 100mL
• Procedimento
• a) Para amostras de sangue com hematócrito acima de 40%,
misturar 1 volume de sangue com 2 volumes de reativo hemolisante;
b) Para amostras de sangue com hematócrito entre 30 e 40%,
misturar 1 volume de sangue com 1 volume de reativo hemolisante;
c) Para amostras de sangue com hematócrito abaixo de 30%,
misturar 2 volumes de sangue com 1 volume de reativo hemolisante.
• A homogeneização deve se processar até a hemólise completa da
mistura. Utilizar o hemolisado após 5 minutos, e no máximo 24 horas
depois da sua preparação.
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PRÍNCIPIO EM pH ALCALINO
• Em pH 8,0 – 9,0 a hemoglobina é uma proteína
carregada negativamente, migrando em direção ao
pólo positivo. Esse método identifica as hemoglobinas
normais e grande parte das variantes. As diferentes
mobilidades verificadas entre as diversas
hemoglobinas com defeitos estruturais se devem às
alterações de cargas elétricas, causadas por
substituições de aminoácidos de diferentes pontos
isoelétricos (pI).
• As hemoglobinas que não envolvem alterações de
cargas elétricas, geralmente apresentam mobilidade
eletroforética semelhante à da Hb A; nesse grupo
situa-se a maioria das hemoglobinas instáveis.
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TÉCNICA
• MATERIAL
• Equipamento
1. Cuba de eletroforese
2. Tiras de acetato de celulose
3. Papel absorvente
4. Aplicador de amostras
• Reagentes
1. Solução tampão: Tris-EDTA-borato 0,025M pH 8,5
(TEB pH 8,5)
Tris-hidroximetil-aminometano............................10,2g
Ácido etileno-diamino-tetracético........................ 0,6g
Ácido bórico......................................................... 3,2g
Água destilada q.s.p.........................................1000mL
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TÉCNICA
• PROCEDIMENTO
1. Colocar igual quantidade de solução tampão
em cada compartimento eletrolítico da cuba de
eletroforese;
2. Embeber o acetato de celulose na solução
tampão, previamente colocada numa vasilha, pelo
menos durante 15 minutos;
3. Enxugar o acetato de celulose entre duas folhas
de papel absorvente para remover o excesso de
solução tampão;
4. Ajustar as tiras de acetato de celulose na cuba
de eletroforese, deixando-as esticadas, utilizando-
se de perfex ou papel de filtro para fazer a ponte
de corrente elétrica na fita;
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TÉCNICA
• PROCEDIMENTO
5. Aplicar as amostras nas tiras de acetato de
celulose (hemolisado com saponina 1%, ou
solução de hemoglobina) há 2 cm do
compartimento do polo negativo;
6. Passar 300 volts por 20 minutos;
7. Analisar o fracionamento, durante os 5
primeiros minutos, observando a presença ou
não de Hb H. A Hb H, quando presente,
somente é possível de ser visualizada em
hemolisados feitos com saponina a 1%.
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TÉCNICA - CONTROLE
• Durante a eletroforese é importante o uso de,
pelo menos, uma amostra controle.
• Na ausência de padrões tipo Hb AS, Hb AC,
ou outra forma de hemoglobina variante, usa-
se uma amostra com hemoglobina normal.
• O padrão normal constitui-se num excelente
meio de comparação entre hemoglobinas
“normais” e “anormais”.
• A utilização de “mapas” de referência é muito
útil na interpretação dos resultados
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PRECAUÇÕES
• Para o uso de qualquer eletroforese são fundamentais os
seguintes cuidados:
1. Verificar se as luvas de mãos, a cuba de eletroforese, as
tiras de acetato, o aplicador e o papel absorvente estão
limpos;
2. Observar se a solução tampão não está contaminada por
colônias de fungos;
3. A solução tampão, usada continuamente, é suficiente para
oito a dez procedimentos seguidos. Porém, no uso
esporádico, por exemplo, uma vez por semana, é
interessante conservar a cuba com tampão na geladeira;
4. A obtenção de fracionamento deficiente pode ser causada
por:
a) solução tampão deteriorada;
b) alteração do pH do tampão;
c) alta molaridade do tampão;
d) corrente elétrica deficiente;
e) má qualidade do acetato de celulose;
f) excesso ou deficiência da amostra aplicada.
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Dosagem de Hb A2 por Eletroforese de
Acetato de Celulose pH 8,0 - 9,0
• Mesma técnica da eletroforese em pH alcalino
• Procedimento específico
• a) Aplicar 20m l da solução de hemoglobina, numa única tira de
acetato de celulose, com 4,5 a 5,5 cm de largura. Para acetato de
celulose com 2,5 cm de largura usar duas tiras, depositando 10m l
em cada uma delas;
b) Passar 300 volts durante 20 minutos;
c) Após o fracionamento, as hemoglobinas A e A2, são recortadas
com tesoura, e eluídas em tubos contendo água destilada, na
quantidade de 3 mL (para a Hb A2) e 9 mL (para a Hb A). Deixar a
eluição se processar por 2 horas à temperatura ambiente,
homogeneizando por inversão os tubos a cada 15 minutos. Nas
eluições superiores a 2 horas, conservar o material sob refrigeração.
d) Usar água destilada como branco, e fazer a leitura em
espectrofotômetro, a 410 nm;
e) Cálculo:
• % Hb A2= DO A2 /DO A X 3 + DO A2 X 100
• VR: 2,0 à 4,0%
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ELETROFORESE EM pH ÁCIDO
• Eletroforese em Ágar pH 6,2
• Princípio
- O emprego da eletroforese em ágar pH 6,2 é
específico para diferenciar alguns tipos de
hemoglobinas mais lentas do que a Hb A, quais
sejam: Hb S da Hb D e Hb C da Hb E, que migram
em posições similares em eletroforeses alcalinas.
Por essa técnica as hemoglbinas S e C separam-
se da Hb A, enquanto as hemoglobinas D e E
migram nas mesma posição da hemoglobina A.
Esse sistema de fracionamento propicia, também,
a quantificação de Hb Fetal.
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ELETROFORESE EM pH ÁCIDO
• Equipamento
1. cuba de eletroforese e fonte geradora de voltagem
2. papel de filtro
3. aplicador de amostra (lamínula ou lâmina de barbear)
4. erlenmayer de 200 a 250 ml
5. lâmina de microscópio
6. pipetas de 10 ml
• Reagentes
1. solução tampão fosfato pH 6,2
Na2HPO4 .............................................................. 2,02g
NaH2PO4 . H2O ..................................................... 0,6g
Água destilada q.s.p..............................................1000ml
Esta solução será usada nos compartimentos
eletrolíticos bem com na preparação do gel de agar.
2. Bacto-ágar (Difco Lab.)
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ELETROFORESE EM pH ÁCIDO
• Procedimento
• 1. colocar no erlenmayer 200mg de agar e dissolve-los em 20ml do
tampão fosfato, levando-o ao fogo e agitando-o rotatoriamente a
cada 10 minutos, até a completa dissolução do agar;
2. pipetar 3,5ml do gel liquefeito em cada lâmina. Esse procedimento
dever ser realizado cuidadosamente: coloca-se a pipeta
verticalmente na porção média da lâmina, e deixa-se que o gel se
escoe lentamente por toda a extensão da lâmina, até completar o
volume 3,5ml, deixar por 10 a 15 minutos em repouso;
3. aplicar as amostras (solução de hemoglobina, ou hemolisado com
saponina) na porção média da lâmina. Para isso usa-se pedaço de
lamínula, ou de lâmina de barbear (tipo Gillette), molhado em sua
extremidade com a amostra a ser analisada. A aplicação se faz
introduzindo verticalmente o aplicador no gel, observando-se o
cuidado de não atingir a lâmina;
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ELETROFORESE EM pH ÁCIDO
4. colocar a lâmina na cuba de eletroforese, e conectar
suas extremidades com os respectivos compartimentos
eletrolíticos por meio de “pontes” realizadas com duplo
papel de filtro;
5. passar 100 a 150 volts por 20 a 15 minutos,
respectivamente;
6. analisar o fracionamento, inicialmente sem corar;
7. remover a lâmina e corar com Ponceau S (ou outro
corante de proteínas) por 20 minutos;
8. descorar com ácido acético a 5%.
• Observação: É possível comprar géis prontos para este
procedimento sob o nome de agarose ácida para
eletroforese de hemoglobinas.
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PERFIL DAS HEMOGLOBINAS
MAIS COMUNS
% ADULTO % FETO
• Hb A - α2 β2 96 - 98 TRAÇOS
• Hb A2 - α2 Δ2 ATÉ 3.5-4.0 TRAÇOS
• Hb F - α2 ץ2 TRAÇOS 99
HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES
• Hb S - α2 β2(6: GLU → VAL)
• Hb C - α2 β2(6: GLU → LIS)
• Hb DLos Angeles-Punjab - α2 β2(121: GLU → GLN)
• Hb MBOSTON - α2(58:HIS →TIR) β2 (Metahemoglobina)
• Hb H - β4
• Hb BARTS - ץ4
HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES
• Hb Lepore - Pareamento não homologo
entre os genes ץe β (Híbrido ץ-β, sendo
a parte inicial, amino terminal semelhante
a gama e a terminal, carboxila,
semelhante a beta)
→ Hemoglobinas Instáveis:
Hb Torino - α2(43:PHE →VAL) β2
Hb Koln - α2 β2(98:VAL → MET)
• Diversidade das Hemoglobinas
anormais
• Variantes – 920
• Talassemia – 300
• Outras – 150
Fonte: http\\www.globin.cse.psu.edu
Prevalecência de Anemia Hereditária
no Brasil
Talassemia alfa-mínima 20 - 25 %
Talassemia alfa-menor 3 - 6%
Deficiência de G6PD em brancos 3 %
Deficiência de G6PD em negros 15 %
Hb AS em brancos 2 %
Hb AS em negros 10 %
Talassemia Beta menor em descendente
de Italiano 1 - 6%
Hb AC em brancos 0.5 %
Hb AC em negros 3 %
Esferocitose 1:500
Eliptocitose 1:500 NAOUN
Talassemia Beta maior 2,5:100.000
Programas de prevenção de
hemoglobinopatias
• 300.000 amostras desde 1982
• Doadores de sangue
• Neonatos
• Estudantes
• Gestantes
Algumas variantes de hemoglobina com importância clínica
% presente em
Origem Substituição de
Hemoglobina heterozigotos
geográfica Aminoácido
* Existem outros variantes de HbG de cadeia a. A HbG Philadelphia é um variante
de cadeia a que frequentemente traz deleção dos alelos não afetados. Quando não
ocorre deleção, existe ~20% de HbG, com deleção de 1 alelo, ~30% de HbG, e com
deleção de 2 alelos, ~40% HbG.
*** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutação.
# Não é uma mutação pontual e sim um produto de crossover durante a meiose.
OUTRAS HEMOGLOBINAS
ANORMAIS
• Hb E - α2 β2(26: GLU → LYS)
• Hb J Baltimore - α2 β2(16: GLY → ASP)
• Hb N Baltimore - α2 β2(95: LYS → GLU)
• Hb O Arábica - α2 β2(121: GLU → LYS)
• Hb Porto Alegre- α2 β2(9: SER → CIS)
• Hb K Woolwich - α2 β2(132: LYS → GLN)
OUTRAS HEMOGLOBINAS
INSTÁVEIS
• Hb Rio Claro - α2 β2(34: VAL → MET)
• Hb Zurich - α2 β2(63: HIS → ARG)
• Hb Santa Ana - α2 β2(88: LEU → PRO)
• Hb Niteroi - α2 β2(42-44:PHE/GLU/SER → 0)
• HB Koln - α2 β2(98: VAL → MET)
• Hb Camperdown - α2 β2(104: ARG → MET)
OUTRAS HEMOGLOBINAS
VARIANTES a
• Hb G Philadelphia - α2 68: ASN →LIS β2
• Hb I - α2 16: LYS →GLU β2
• Hb J Oxford - α2 15: GLY →ASP β2
• Hb J Rovigo - α2 53: ALA →ASP β2
• Hb Constant Spring - α2 142: STOP →GLN β2
OUTRAS HEMOGLOBINAS
INSTÁVEIS a
• Hb Hasharon - α2 47: ASP →HIS β2
• Hb Stanleyville II - α2 78: ASN →LIS β2
• Hb G Pest - α2 74: ASP →ASN β2
• Hb Kurosaki - α2 7 : LYS →GLU β2
• Hb Westmead - α2 122: HIS →GLN β2
• Hb Campinas - α2 26: ALA →VAL β2
A Hemoglobina Porto Alegre
• Origem geográfica: região de São Leopoldo, RS, Brasil
• mutação pontual com substituição de Ser por Cys na
posicão 9 da cadeia na região helicoidal A6
• por conter uma cisteína a mais, a HbPorto Alegre
apresenta tendência de polimerizar, fazendo tetrâmeros
via pontes –S-S-
• a polimerização é baixa in vivo, mas intensa em
hemácias armazenadas (diminuição do poder redutor)
Tetrâmero de HbPA
• veja artigo e texto complementar para mais informações.
Microscopia eletrônica de tetrâmeros de HbPa
Prevalência de hemoglobinopatias em 238 amostras
coletadas para estudo eletroforético de hemoglobinas no
Laboratório lâmina-Rj, no ano de 2000.
• 61 FITAS(25,6%) APRESENTARAM HEMOGLOBINAS
ANÔMALAS:
• Talassemia Alf a : 6/61 – 10%
• Talassemia Beta : 23/61 - 38 %
• Hemoglobinopatia AS: 22/61 – 36%
• Hemoglobinopatia AC: 3/61 – 5%
• Hemoglobinopatia AD: 1/61 – 1.5%
• Hemoglobinopatia SS: 1/61 - 1.5%
• Persistência Hereditária
de Hemoglobina Fetal: 5/61 - 8%
DOS TALASSÊMICOS:
• Talassemia Minor : 19/23 - 82%
• Talassemia Intermedia : 4/ 23 - 18%
Ricardo P. Ducatti
LEPAH-CBB-UCG
ELETROFORESE EM PH
ALCALINO
ELETROFORESE
• É definido como sendo a migração de
espécies carregadas eletricamente, que
ocorre quando as mesmas são dissolvidas
ou suspensas em um eletrólito, através do
qual uma corrente elétrica é aplicada.
• Esta técnica de separação foi
desenvolvida pelo químico Arne Tiselius
para o estudo de proteínas em soro e por
este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel
em 1948.
PERFÍS ELETROFORÉTICOS
• A
- A : NORMAL
• A
- S : Traço Falciforme (Banda A e S)
• S
- S : Anemia Falciforme (Banda S)
• S
- C : Falciforme/ Hb C (Banda S e C)
• - βTal : Micro-Drepanocitose (Banda
S
S e aumento de A2 e F)
• S - αTal : Banda S e Hb H
• A - C : Hetereozigoto para Hemoglobina C
• C - C : Homozigoto para Hemoglobina C
SEQUÊNCIA BÁSICA DA
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS
EM pH alcalino
(-) (+)
• A2 G S K F A B
OA
H J I
RR
C D L
E
T
s
Bu
E D Los Angeles-Punjab
Lepore
SC AA
A
F
S D
A2 C E
Traço talassêmico Hb A2 = 5,5%
A2 D
Hb F = 9% Persistência hereditária de Hb fetal
B
A
R
A2 D T H
S
Doença da Hemoglobina H e BARTS
ELETROFORESE DE Hb
BART’S E Hb H
A2 D
LEPORE
Hemoglobina Lepore (10 %)
ALTERAÇÕES NA ESTRUTURA QUÍMICA DA
MOLÉCULA POR TROCA DE AMINOÁCIDOS
Hb A- pI 6.8
HbS - pI 6.85
HbG - pI 6.90
HbC - pI 6.95
Hb S: Glu (-) → Val (o): pI 6.85
Hb G: Asn (o) → Lis (+): pI 6.90
Hb C: Glu (-) → Lis (+): pI 6.95
P.C.NAOUM, 2001
A
F
S/D
A2/C/E
COLORAÇÃO SUPRA VITAL
AZUL DE CRESIL BRILHANTE
ELETROFORESE EM pH
ALCALINO, COM
HEMOLISADO COM
SAPONINA
ELETROFORESE EM PH
ACIDO
ELETROFORESE ÁGAR-ÁCIDO
ELETROFORESE ÁGAR-
ÁCIDO
ELETROFORESE COM
ISOFOCALIZAÇÃO
ELETROFORESE DE
CADEIAS DE GLOBINAS
ELETROFORESE CAPILAR
ELETROFORESE MICROCAPILAR
ELETROFORESE CAPILAR
• Técnica que foi introduzida em 1981, por
Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita
cada vez mais, como um importante
método analítico.
• Em sua forma mais simples é uma
aproximação da técnica original, descrita
por Tiselius, porém emprega-se um tubo
capilar, preenchido com um eletrólito,
conforme o próprio nome sugere.
• Pode ser usada na determinação de
hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas
hidro e lipossolúveis, aminoácidos, íons
inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos,
catecolaminas, substâncias quirais,
proteínas, peptídeos, etc.
Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz
Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (Universidade Estadual de Campinas,
Instituto de Química),
http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm
• Uma característica é a sua capacidade
única para separar macromoléculas
carregadas eletricamente de interesse tanto
em indústrias de biotecnologia quanto em
pesquisas biológicas.
• No projeto Genoma Humano foi necessário
distinguir os diversos polinucleotídeos, com
massas molares, por volta de 200 a 500
Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre
si por um único nucleotídeo.
• Somente a EC tem resolução suficiente
para este tipo de separação.
• Além disso, o DNA humano contém cerca
de 3 bilhões de nucleotídeos e as altas
velocidades de análises, obtidas pela EC,
permitiram que milhares de nucleotídeos
fossem seqüenciados em um único dia
• O funcionamento do equipamento
envolve a aplicação de alta voltagem,
tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de
diâmetro reduzido gerando correntes na
faixa de 10 a 100 mA.
• O uso do capilar apresenta várias
vantagens, particularmente com respeito
ao aquecimento Joule.
• A alta resistência elétrica do capilar
permite a aplicação de campos elétricos
altos pois gera um aquecimento mínimo.
• Além disso o formato de capilar propicia
uma dissipação eficiente do calor gerado.
• O uso de campos elétricos altos resulta
em tempo de análise curto, alta eficiência
e resolução.
• O capilar é preenchido com uma solução
tampão e suas extremidades são
mergulhadas em recipientes, que contém
a solução tampão, e onde é aplicado um
campo elétrico, que gera uma corrente no
interior do capilar.
• Os eletrodos são feitos de um material
inerte, tal como, platina, e são também
mergulhados na solução para fechar o
circuito.
• O capilar passa através de um detector,
usualmente um detector
espectrofotométrico de absorção no
UV/Vis
VANTAGENS
• Rapidez
• Versatilidade
• Baixo custo por análise
• Alto poder se separação (resolução)
• Consumo mínimo de amostras, reagentes
e solventes.
• Possibilidade de automação e detecção
on-line.
DESVANTAGENS
• Não é adequada para a determinação de
compostos voláteis, não-polares e de
massa molar baixa, os quais são melhores
determinados por cromatografia gasosa.
• Também não é muito adequada para a
análise de polímeros não iônicos de
massa molar alta
• Não é tão sensível quanto a cromatografia
líquida de alta performace
Mecanismos de separação em eletroforese capilar.. Marina F. M.
Tavares.Quimica Nova
HPLC
Metodologia automatizada que a partir da cromatografia por
troca iônica permite separar e definir a porcentagem de
diferentes hemoglobinas de uma forma precisa e rápida.
GEL CENTRIFUGAÇÃO
PARA Hb S
ID FALCIFORME, DIAMED®
• TESTE DE FALCIZAÇÃO
SOLUBILIDADE
DA
HEMOGLOBINA
EM TUBO E PAPEL
6.2
8.2
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA PELA PCR
Bio-Rad®
