Centrifugación

Centrífuga de laboratorio

A centrifugación é un proceso mecánico no que se utiliza a forza centrífuga para separar partículas dunha solución de acordo co seu tamaño, forma, densidade, viscosidade do medio e velocidade do rotor. Os compoñentes máis densos da mestura migran lonxe do eixe da centrífuga (aparello utilizado para o proceso), mentres que os menos densos fano cara a dito eixe. Os químicos e biólogos poden incrementar a forza gravitacional efectiva do tubo de ensaio para que o precipitado (pellet) viaxe máis rapidamente e chegue ata o mesmo fondo do tubo. O líquido restante que queda por riba do precipitado denomínase sobrenadante.

Hai unha correlación entre o tamaño e a densidade dunha partícula e a velocidade con que esa partícula se separa dunha mestura heteroxénea cando a única forza que se aplica é a da gravidade. Canto maiores son o tamaño e a densidade das partículas, máis rápido se separan da mestura. Aplicando unha forza gravitatoria efectiva maior á mestura, como fai unha centrífuga, acelérase a separación das partículas. Isto é ideal en instalacións industriais e de laboratorio porque as partículas ás que lles levaría un longo período de tempo separarse gravitatoriamente de forma natural poden separarse en moito menos tempo.

A velocidade de centrifugación está especificada pola velocidade angular, xeralmente expresada en revolucións por minuto (RPM), ou como aceleración g. O factor de conversión entre as RPM e g depende do raio do rotor da centrífuga. A velocidade de sedimentación das partículas na centrifugación é función do seu tamaño e forma, aceleración centrífuga, fracción en volume dos sólidos presentes, diferenza de densidades entre a partícula e o líquido, e viscosidade. A aplicación máis común é a separación de sólidos de suspensións altamente concentradas, o cal se usa no tratamento de lodo de augas residuais para deshidratalo cando se producen sedimentos pouco consistentes.

O método de centrifugación ten unha ampla variedade de aplicacións industriais e de laboratorio; non só é un proceso utilizado para separar dúas substancias miscibles, senón tamén para analizar as propiedades hidrodinámicas das macromoléculas. É un dos métodos de investigación máis importantes e máis comunmente utilizados en bioquímica, bioloxía celular e bioloxía molecular. Nas industrias química e alimentaria, as centrífugas especiais poden procesarse nun fluxo continuo de partículas que van sendo separadas en líquidos como o plasma sanguíneo. A centrifugación é tamén o método máis común para conseguir o enriquecemento do uranio, aproveitando a lixeira diferenza de masa entre os isótopos U-238 e U-235 no gas hexafluoruro de uranio.

Fórmula matemática

Nunha suspensión líquida moitas partículas ou células caen gradualmente de forma espontánea ao fondo do contedor debido á gravidade; porén, a cantidade de tempo que levan ditas separacións fai que non sexan factibles ou útiles. Outras partículas, que son moi pequenas, non poden illarse en absoluto en solución a non ser que sexan expostas a unha alta forza centrífuga. A medida que a suspensión rota a unha certa velocidade ou revolucións por minuto (RPM), a forza centrífuga permite que as partículas viaxen radialmente afastándose do eixe de rotación. A fórmula xeral para calcular as revolucións por minuto (RPM) dunha centrífuga é:

$RPM={\sqrt {g \over r}}$,

onde g representa a forza respectiva da centrífuga e r o raio desde o centro do rotor ata un punto da mostra.

Porén, dependendo do modelo de centrífuga usado, poden variar o ángulo respectivo do rotor e o raio, e así a fórmula queda modificada. Por exemplo, o rotor Sorvall #SS-34 ten un raio máximo de 10,8 cm, así que a fórmula queda ${\textstyle RPM=299{\sqrt {g \over r}}}$, que pode simplificarse máis a ${\textstyle RPM=91{\sqrt {g}}}$.

Cando se compara coa gravidade, a forza da partícula chámase forza centrífuga relativa (FCR). É a forza perpendicular exercida sobre os contidos do rotor como resultado da rotación, sempre en relación á gravidade da Terra, a cal mide a forza dos rotores de diferentes tipos e tamaños. Por exemplo, unha FCR de 1000 x g significa que a forza centrífuga é 1000 veces máis forte que a forza gravitacional terrestre. A FCR depende da velocidade de rotación en rpm e a distancia á que están as partículas desde o centro de rotación. A fórmula máis común usada para calcular a FCR é:

$FCR=1,118\times 10^{-5}\times r\times (rpm)^{2}$,

onde ${\textstyle 1,118\times 10^{-5}}$ é unha constante; r é o raio, expresado en centímetros, entre o eixe de rotación e o centro; e rpm é a velocidade en revolucións por minuto.

Historicamente, leváronse a cabo moitas separacións á velocidade de 3000 rpm; unha guía aproximada da forza ‘g’ exercida a esa velocidade é multiplicar o raio de centrifugación por un factor de 10, así que un raio de 160 mm dá aproximadamente 1600 x g. Esta é unha aproximación bastante arbitraria, xa que a FCR aplicada é dependente linearmente do raio, así un raio un 10% máis grande significa que se aplica unha FCR un 10% maior á mesma velocidade. De forma aproximada, a fórmula de arriba pode simplificarse a ${\textstyle FCR=10\times r}$, cun erro de só o 0,62%.

A centrifugación na investigación biolóxica

Microcentrífugas

As microcentrífugas están especialmente deseñadas como modelos pequenos que se poñen sobre unha mesa, con rotores lixeiros de pequeno volume capaces de realizar aceleracións rápidas de ata aproximadamente 17.000 rpm. Son aparellos de pouco peso usados principalemtne para centrifugacións en curto espazo de tempo de mostras de ata uns 0,2–2,0 mL. Porén, debido á súa pequena escala, son doadamente trransportables e, se for necesario, poden funcionar nunha habitación fría. Poden ser refrixeradas ou non. A microcentrífuga úsase normalmente en laboratorios de investigación nos que hai que someter pequenas mostras de moléculas biolóxicas, células ou núcleos celulares a unha alta FCR en curtos intervalos de tempo. As microcentrífugas deseñadas para funcionar a alta velocidade poden acadar ata as 35.000 rpm, dando RCF de ata 30000×g, e denomínanse microcentrífugas de alta velocidade.

Centrífugas de baixa velocidade

As centrífugas de baixa velocidade utilízanse para recoller precipitados químicos, células intactas (de animais, plantas e algúns microorganismos), núcleos, cloroplastos, grandes mitocondrias e os fragmentos máis grandes de membrana plasmática. Os gradientes de densidade para purificar células tamén se poden utilizar nestas centrífugas. Os rotores de pa basculante (permiten que o tubo varíe de ángulo durante o funcionamento) adoitan usarse moito debido á gran flexibilidade de tamaño de mostra co uso de adaptadores. Estas máquinas teñen velocidades de rotor máximas de menos de 10.000 rpm e varían desde pequenas centrífugas para poñer enriba dunha mesa a grandes instaladas no chan.

Centrífugas de alta velocidade

As centrífugas de alta velocidade son usados normalmente para recoller microorganismos, virus, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas e membranas do aparato de Golgi tubulares intactas. A maioría das tarefas simples de precipitación lévanse a cabo con ángulos fixos do rotor. Algúns traballos de gradiente de densidade para purificar células e orgánulos poden realizarse en rotores de pas basculantes, ou no caso de gradientes de Percoll con ángulos de rotor fixos. As centrífugas de alta velocidade ou de supervelocidade poden tratar volumes de mostra máis grandes, desde unhas poucas decenas de mililitros a varios litros. Adicionalmente, centrífugas máis grandes poden tamén acadar velocidades angulares máis grandes (arredor de 30.000 rpm). Os rotores poden vir con diferentes adaptadores para albergar varios tamaños de tubos de ensaio, botellas ou placas de microtitulación.

Ultracentrifugacións

A ultracentrifugación utiliza unha alta forza centrífuga para estudar as propiedades de partículas biolóxicas e velocidades excepcionalmente altas. Como as ultracentrífugas actuais poden xirar a 150.000 rpm (equivalente a 1.000.000 x g). Utilízanse para recoller todas as vesículas de membrana derivadas da membrana plasmática, retículo endoplasmático e aparato de Golgi, endosomas, ribosomas, subunidades ribosómicas, plásmidos, ADN, ARN e proteínas en rotores de ángulo fixo. Comparadas coas microcentrífugas ou centrífugas de alta velocidade, as ultracentrífugas poden illar partículas moito máis pequenas e, ademais, mentres que as microcentrífugas e supercentrífugas separan as partículas en lotes (deben tratarse volumes limitados de mostras en tubos de ensaio ou botellas), as ultracentrífugas poden separar moléculas en lotes ou en sistemas de fluxo continuo.

A ultracentrifugación emprégase para a separación en estudos cinéticos da unión macromoléculas/ligandos, separación de varias fraccións de lipoproteínas do plasma e desprotonación de fluídos fisiolóxicos para a análise de aminoácidos.

Son as centrífugas máis usadas para a purificación en gradiente de densidade de todas as partículas excepto células, e, aínda que se utilzaron tradicionalmente os rotores basculantes para este propósito, tamén se usan os rotores de ángulo fixo e os rotores verticais, especialmente para gradientes autoxerados e poden mellorar moito a eficiencia da separación. Hai dous tipos de ultracentrífugas: a analítica e a preparativa.

Ultracentrifugación analítica

A ultracentrifugación analítica pode utilizarse para a determinación das propiedades de macromoléculas como a forma, masa, composición e conformación. É unha técnica de análise biomolecular comunmente usada para avaliar a pureza da mostra, para caracterizar os mecanismos de ensamblaxe e desensamblaxe de complexos biomoleculares, para determinar as estequiometrías das subunidades, para identificar e caracterizar os cambios conformacionais macromoleculares e para calcular as constantes de equilibrio e os parámetros termodinámicos para sistemas de autoasociación e heteroasociación. As ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección baseado na luz visible/ultravioleta de escaneo para a monitorización en tempo real do progreso da mostra durante un xiro.

As mostas son centrifugadas cunha solución de alta densidade como a sacarosa, cloruro de cesio ou iodixanol. A solución de alta densidade pode estar a unha concentración uniforme a través do tubo de ensaio ou a unha concentración que varía ("gradiente"). As propiedades moleculares poden ser modeladas por análise da velocidade de sedimentación ou análise de equilibrio de sedimentación. Durante o funcionamento, a partícula ou moléculas migran a través do tubo de ensaio a diferentes velocidades dependendo das súas propiedades físicas e as propiedades da solución e finalmente forman un precipitado no fondo do tubo ou bandas a varias alturas.

Ultracentrifugación preparativa

As ultracentrífugas preparativas úsanse a miúdo para separar partículas segundo as súas densidades, illando e/ou recollendo as partículas máis densas no precipitado, e clarificando as suspensións que conteñen partículas. Algúns investigadores tamén usan ultracentrífugas preparativas se necesitan flexibilidade para cambiar o tipo do rotor no instrumento. As ultracentrífugas preparativas poden ser equipadas cunha ampla gama de tipos de rotores, que poden facer xirar as mostras en diferente número, a diferentes ángulos e a distintas velocidades.

Proceso de fraccionamento

En investigacións biolóxicas, o fraccionamento celular comprende normalmente o illamento de compoñentes celulares á vez que conservan os papeis de cada compoñente. Xeralmente, a mostra celular almacénase nunha suspension que é:

• tamponada, de pH neutro, o que impide danos na estrutura de proteínas incluíndo encimas (que podían afectar aos enlaces iónicos)
• isotónica (de igual potencial hídrico); isto impide a ganancia ou perda de auga polos orgánulos
• fría, o que reduce a actividade global de encimas liberados máis tarde no procedemento.

A centrifugación é o primeiro paso na maioría dos fraccionamentos. Por medio de centrifugación a baixa velocidade, deben retirarse os residuos celulares, deixando un sobrenadante que preseve os contidos da célula. A centrifugación repetida sucesivamente a velocidades progresivamente maiores fraccionará os homoxenados de células nos seus compoñentes. En xeral, canto maior é o compoñente subcelular, maior é a forza centrífuga necesaria para que sedimente. A fracción soluble de calquera lisado pode despois separarse nos seus compoñentes usando diversos métodos.

Centrifugación diferencial

A centrifugación diferencial é o método máis simple de fraccionamento por centrifugación, usado comunmente para separar orgánulos e membranas de células. Os orgánulos difiren xeralmente uns dos outros en densidade e tamaño, facendo posible o uso da centrifugación diferencial e a centrifugación en xeral. Os orgánulos poden despois ser identificados comprobando os indicadores que son únicos de cada orgánulo específico. A aplicación máis amplamente usada desa técnica é producir fraccións subcelulares crúas dun homoxenado de tecido como o de fígado de rata. As partículas de diferentes densidades ou tamaños nunha suspensión sedimentan a diferentes velocidades, e as partículas máis grandes e densas sedimentan máis rápido. Estas velocidades de sedimentación poden incrementarse usando a forza centrífuga.

Unha suspensión de células sométese a unha serie de ciclos de forza centrífuga crecente para producir unha serie de precipitados que conteñen células cunha velocidade de sedimentación decrecente. O homoxenado inclúe núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, láminas de membrana plasmática e un amplo rango de vesículas derivadas dun número de compartimentos de membrana intracelulares e tamén da membrana plasmática, tipicamente nun medio tamponado.

Centrifugación en gradiente de densidade

A centrifugación en gradiente de densidade é un dos métodos máis eficientes para separar partículas en suspensión, e utilízase tanto como técnica de separación coma como método para medir a densidade de partículas ou moléculas nunha mestura.

Úsase para separar prtículas baseándose no seu tamaño, forma e densidade utilizando un medio de densidade graduada. Durante unha centrifugación relativamente curta ou lenta, as partículas sepáranse por tamaño, e as partículas maiores sedimentan máis que as máis pequenas. Durante unha centrifugación longa ou rápida, as partículas viaxan a posicións no gradiente nas que a densidade do medio é a mesma que a densidade da partícula; (ρp – ρm) → 0. Por tanto, unha partícula pequena densa sedimenta inicialmente con menor facilidade que unha grande e de baixa densidade. As partículas grandes chegan á súa posición de equilibrio de densidade axiña, mentres que as pequenas partículas migran lentamente a través da zona de grandes partículas e finalmente quedan nunha posición de equilibrio máis profunda no gradiente.

Un tubo que foi centrifugado por este método ten as partículas ordenadas por densidade segundo a altura no tubo. O obxecto ou partícula de interese situarase na posición no tubo correspondente á súa densidade. Non obstante, cando se usa este método son aínda posibles algúns casos de sedimentacións non ideais. O primeiro posible problema é a agregación non desexada das partículas, mais isto pode ocorrer en calquera centrifugación. A segunda posibilidade ocorre cando as pingas de solución que conteñen partículas sedimentan. Isto é máis probable que ocorra cando se traballa cunha solución que ten unha capa de suspensión flotando nun líquido denso, que, de feito, ten pouco ou ningún gradiente de densidade.

Outras aplicacións

Poden usarse as centrífugas para illar pequenas cantidades de sólidos retidos en suspensión en líquidos, como na separación do po de xiz da auga. En investigación biolóxica pode usarse na purificación de células de mamífero, o fraccionamento de orgánulos subcelulares, fraccionamento de vesículas membranosas, fraccionamento de macromoléculas e complexos macromoleculares etc. A centrifugación utilízase tamén de moi diversas maneiras na industria alimentaria. Por exemplo, na industria láctea o seu uso é habitual para a clarificación e desnatado do leite, extracción de tona do leite, produción e recollida de caseína, produción de queixo, eliminación de contaminantes bacterianos etc. Esta técnica de procesamento tamén se usa na produción de bebidas, zumes, café, té, cervexa, viño, bebida de soia, procesamento e recollida de aceites e graxas, manteiga de cacao, produción de azucre etc. Tamén se utiliza na clarificación e estabilización do viño.

En laboratorios forenses e de investigación pode usarse para a separación de urina e compoñentes do sangue. Tamén axuda á separación de proteínas usando técnicas de purificación como a precipitación salina, por exemplo, precipitación de sulfato amónico. Tamén é unha técnica importante no tratamento de augas residuais, sendo un dos procesos máis comúns para a deshidratación de lodos residuais. Esta técnica tamén ten o seu papel na separación ciclónica, na cal as partículas se separan dun fluxo de aire sen usar filtros. Nun colector ciclónico o aire móvese seguindo un traxecto helicoidal. As partículas con alta inercia sepáranse pola forza centrífuga, mentres que as partículas máis pequenas continúan no fluxo de aire.

As centrífugas utilizáronse en pequena medida para illar compostos máis lixeiros que a auga, como o aceite. Nesas situacións, sepárase a auga dos sólidos cunha gravidade específica maior que 1, que son os produtos buscados.

Historia

En 1923 Theodor Svedberg e o seu estudante H. Rinde analizaron soles de gran groso en canto á súa sedimentación gravitacional. Un sol está formado por unha substancia distribuída uniformente noutra substancia, e tamén se chama coloide. Porén, os soles de gran máis fino, como os que contiñan ouro, non podían ser analizados. Para investigar este problema Svedberg desenvolveu unha centrífuga analítica, equipada cun sistema de absorción fotográfico, que exercería un efecto centrífugo moito máis grande. Ademais, desenvolveu a teoría necesaria para medir pesos moleculares. Durante esa época, a atención de Svedberg cambiou do ouro ás proteínas.

En 1900 aceptábase xeralmente que as proteínas estaban compostas de aminoácidos; porén, aínda se discutía se as proteínas eran coloides ou macromoléculas. Unha proteína que se estaba investigando daquela era a hemoglobina. Determinouse que tiña 712 átomos de carbono, 1.130 de hidróxeno, 243 de oxíxeno, 2 de xofre e polo menos 1 átomo de ferro. Isto dáballe á hemoglobina un peso resultante de aproximadamente 16.000 daltons (Da), pero era dubidoso se este valor era un múltiplo de 1 ou de 4 (dependendo do número de átomos de ferro presentes).

Por medio dunha serie de experimentos que utilizaron a técnica do equilibrio de sedimentación, fixéronse dúas importantes observacións: a hemoglobina ten un peso molecular de 68.000 Da, o que indica que ten 4 átomos de ferro e non 1, e que, non importaba de onde se illase a hemoglobina, porque sempre tiña exactamente o mesmo peso molecular. Que a masa dunha molécula tan grande se puidese obter consistentemente e sen importar de que parte do corpo se tomase a mostra, era algo sen precedentes e apoiaba a idea de que as proteínas son macromoléculas e non coloides. Para investigar este fenómeno, compría ter unha centrífuga con velocidades incluso maiores, e creouse a ultracentrífuga para aplicar a teoría da sedimentación-difusión. Coa ultracentrífuga determinouse a mesma masa molecular e a presenza dun límite de espallamento suxería que era unha soa partícula compacta. Ulteriores aplicacións da centrifugación mostraron que en diferentes condicións as grandes partículas homoxéneas podían desfacerse en subunidades discretas. O desenvolvemento da centrifugación foi un grande avance na ciencia das proteínas experimental.

Linderstorm-Lang descubriu en 1937 que podían utilizarse tubos de gradiente de densidade para medidas de densidade. Descubriu isto cando traballaba co virus PYDV, que afecta a pataca. Este método tamén se utilizou no famoso experimento de Meselson e Stahl, no cal probaron que a replicación do ADN é semiconservativa usando diferentes isótopos do nitróxeno. Usaron a centrifugación en gradiente de densidade para determinar que isótopos do nitróxeno estaban presentes no ADN despois de determinado número de ciclos de replicación.

Véxase tamén

Outros artigos

• Centrífuga

Bibliografía

• Harrison, Roger G., Todd, Paul, Rudge, Scott R., Petrides D.P. Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press, 2003.
• Dishon, M., Weiss, G.H., Yphantis, D.A. Numerical Solutions of the Lamm Equation. I. Numerical Procedure. Biopolymers, Vol. 4, 1966. pp. 449–455.
• Cao, W., Demeler B. Modeling Analytical Ultracentrifugation Experiments with an Adaptive Space-Time Finite Element Solution for Multicomponent Reacting Systems. Biophysical Journal, Vol. 95, 2008. pp. 54–65.
• Howlett, G.J., Minton, A.P., Rivas, G. Analytical Ultracentrifugation for the Study of Protein Association and Assembly. Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 10, 2006. pp. 430–436.
• Dam, J., Velikovsky, C.A., Mariuzza R.A., et al. Sedimentation Velocity Analysis of Heterogeneous Protein-Protein Interactions: Lamm Equation Modeling and Sedimentation Coefficient Distributions c(s). Biophysical Journal, Vol. 89, 2005. pp. 619–634.
• Berkowitz, S.A., Philo, J.S. Monitoring the Homogeneity of Adenovirus Preparations (a Gene Therapy Delivery System) Using Analytical Ultracentrifugation. Analytical Biochemistry, Vol. 362, 2007. pp. 16–37.