bioteknologi

I de fleste bakterier findes der ved siden af bakteriens kromosom små cirkulære DNA-molekyler kaldet plasmider. De indeholder bl.a. sekvensområder, der sikrer plasmidets selvstændige eksistens og formering i bakterien. Hos forskellige bakterier har man fundet en særlig gruppe enzymer, restriktionsenzymer, der spalter dobbeltstrengede DNA-molekyler på ganske bestemte steder. Nogle plasmider vil kun blive spaltet på et enkelt sted af et bestemt restriktionsenzym og bliver derved ændret fra et cirkulært til et lineært DNA-molekyle. Ligeledes kender man et andet bakterielt enzym, DNA-ligase, som er i stand til atter at sammenkoble de ituskårne DNA-molekyler.

Grundlaget for gensplejsning er, at DNA, som indeholder genet for det ønskede protein, spaltes med et restriktionsenzym. De fremkomne DNA-fragmenter blandes med spaltet plasmid-DNA, og ved DNA-ligasens virkning vil der dannes alle mulige kombinationer af plasmid-DNA og det ituskårne fremmede DNA. Ved at behandle bakterier med høje koncentrationer af et calciumsalt kan man få dem til at optage DNA fra omgivelserne, fx plasmid-DNA. Det er derefter muligt at finde de bakterier, der netop har optaget et plasmid, hvori det søgte gen er blevet indsat. Man siger, at plasmidet bruges som en vektor til at overføre det ønskede gen til disse bakterier.

Det vist sig, at der tæt op ad hvert gen findes et område på DNA, kaldet en promotor, som bestemmer, hvor meget af det pågældende protein der skal produceres. Ved at gensplejse en promotor, som giver en meget høj proteinproduktion, ind i et plasmid, kan det ønskede protein komme til at udgøre helt op til 10% af cellernes proteiner.

Blandt de talrige proteiner, som dannes i bakterier, er der enkelte, der udskilles til omgivelserne gennem bakteriernes cellevæg. Det har vist sig, at udskillelsesmekanismen styres af en rækkefølge på ca. 20 aminosyrer i den ene ende af proteinkæden. Hos en bakterie som Bacillus subtilis vil alle proteinmolekyler, der er forsynet med en sådan sekvens, blive udskilt til vækstmediet. Dette princip benyttes også i bioteknologi, idet man kan konstruere plasmider, hvori et gen altid bliver indbygget i umiddelbar forlængelse af udskillelsessekvensen.

Gensplejsning gør det desuden muligt at fremstille proteiner med ændrede aminosyrer i bestemte positioner. Det har man fx gjort med vaskemiddelenzymet subtilisin, idet en enkelt aminosyreudskiftning gør enzymet ufølsomt over for de blegemidler, der findes i vaskemidler. Det er et eksempel blandt mange på, at man ud fra kendskab til proteiners tredimensionale struktur kan ændre deres egenskaber ved udskiftning af visse aminosyrer (protein engineering).

Som nævnt var human insulin et af de første proteiner, som blev fremstillet industrielt af bakterier og gær vha. gensplejsning. De to korte polypeptidkæder, som danner det aktive insulinmolekyle, blev først produceret hver for sig af Escherichia coli bakterier og efter oprensning kemisk sammenkoblet til aktive insulinmolekyler. I løbet af få år blev det således muligt at erstatte produktionen af insulin ud fra bugspytkirtler fra svin og køer med gæring i store dyrkningstanke. Dyrkningen af bakterier og gær i industriel skala i tanke på ca. 80.000 liter er relativt simpel og billig og kan give stort udbytte af proteiner. Derimod er det resursekrævende og ofte dyrt at oprense proteinerne, især til medicinsk anvendelse, som har meget høje renhedskrav.

Produktion af proteiner ved dyrkning af gensplejsede bakterier støder i visse tilfælde på praktiske problemer. Det forekommer ofte, at proteinerne ikke bliver foldet på den korrekte måde, dvs. ikke får den korrekte tredimensionale struktur og derfor udfældes inde i bakterierne. Dette sker især, når proteinerne produceres i meget høje koncentrationer. I celler fra mennesker og dyr bliver proteinerne desuden ofte modificeret, efter at de er færdigdannet, fx ved påkobling af sukkermolekyler til proteinet. Sådanne glykosyleringer af proteiner foregår ikke i bakterier. For også at få glykosyleret proteinerne kan gensplejsningen fx foretages i gær- eller pattedyrceller.

I produktionen af visse proteiner — ofte produkter af medicinsk interesse — må man gå andre veje for at få fremstillet proteinet i den ønskede form. Således kan man fx indføre det ønskede gen i insektceller vha. en virus, Baculovirus, der benyttes som vektor og kun vokser i disse celler. Herved kan det ønskede protein dannes med meget højt udbytte i en form, der er korrekt foldet og modificeret.

For at producere større og mere komplicerede proteiner med korrekt foldning og med de samme modifikationer, som dannes i menneske- og dyreceller, kræves ofte produktion i dyriske celler. Pattedyrceller er ofte vanskelige og omkostningskrævende at dyrke, men de producerer korrekt glykosylerede proteiner og er derfor at foretrække, når det drejer sig om produkter til medicinsk anvendelse. Det første lægemiddel, som blev produceret i kulturer af gensplejsede dyreceller, var enzymet vævsplasminogen-aktivator, tPA. Dette er en protease, dvs. et enzym, der spalter andre proteiner. Det virker ved at spalte det inaktive forstadium plasminogen til enzymet plasmin, også en protease, der nedbryder det fibrin, som danner blodpropper. Indsprøjtning af tPA hurtigt efter et hjerteanfald kan opløse blodpropper i hjertet, så hjertemuskulaturen ikke lider skade; tPA er et af flere proteiner, der produceres i industriel skala af kulturer af pattedyrceller.

Et andet bioteknologisk område er produktion af monoklonale antistoffer, dvs. helt rene og specifikke antistoffer fremstillet i cellekultur, som først beskrevet af Georges Köhler og César Milstein i 1975 (nobelpris 1984). Disse antistoffer kan fremstilles i stor skala ved dyrkning af såkaldte hybridomceller. Monoklonale antistoffer kan i dag også fremstilles ved gensplejsning af antistofgener og produceres af celler, som har fået overført det pågældende gen.

Til medicinsk anvendelse foretrækkes humane antistoffer eller såkaldte kimæriske eller humaniserede antistoffer, der er gensplejsede kombinationer af sekvenser fra menneske- og muse-antistoffer. Dette skyldes, at de sædvanlige monoklonale antistoffer, der ofte stammer fra mus, er fremmede proteiner, som udløser en immunologisk reaktion, når de indgives til patienter, og bl.a. derfor elimineres så hurtigt fra blodbanen, at de ikke får tid til at udøve deres effekt. De kimæriske eller humaniserede antistoffer er derimod praktisk taget identiske med humane antistoffer og udløser derfor ingen immunologisk reaktion.

Ud over bakterier, gær og cellekulturer til produktion af proteiner kan man tilsvarende indføre ønskede gener i højere organismer som planter og dyr; derved opstår de såkaldte transgene organismer. Transgene planter har store anvendelsesmuligheder, idet man kan fremstille planter, som har fået overført et gen, der forbedrer plantens egenskaber.

Til at overføre gener til planter kan man bl.a. anvende et plasmid fra bakterien Agrobacterium tumefaciens som vektor. Denne bakterie kan overføre plasmidet til enkelte planteceller, der siden kan opdyrkes til en hel plante. Fx kan man fremstille transgene bomuldsplanter, som producerer et toksin, der slår insektlarver ihjel og derfor beskytter planten mod insektangreb. Et andet eksempel er gensplejsede kartoffelplanter, som er særlig modstandsdygtige over for angreb af bestemte virus.

I Danmark har man fremstillet sukkerroer, som er specielt modstandsdygtige over for ukrudtsbekæmpelsesmidler. Et amerikansk firma har fremstillet en transgen tomatplante, hvori man har elimineret et enzym (polygalakturonidase), der nedbryder pektin. Idet sædvanlige tomatplanter indeholder enzymet, plukkes tomaterne, inden de er modne, og mens de stadig er faste og tåler transport. De gensplejsede tomater kan derimod plukkes, når de er modne, da de bedre tåler transport, fordi pektinet i dem ikke bliver nedbrudt. De kan da bringes til forbrugerne i moden og mere velsmagende tilstand. Ved brug af transgene dyr kan man producere en lang række proteiner i mælk eller blod, hvorfra disse proteiner let kan oprenses. Anvendelse af transgene organismer rejser dog en række etiske og lovgivningsmæssige spørgsmål.

Genterapi er et nyt område inden for bioteknologien, hvor gener kan overføres til bl.a. menneskeceller, såvel kønsceller som kropsceller (somatiske celler). Den første mulighed indebærer store etiske betænkeligheder, da det tilførte gen bliver arveligt, mens den anden giver mulighed for at behandle det enkelte individ for genetisk betingede sygdomme, dvs. medfødte arvelige sygdomme og en række andre sygdomme som fx visse kræftformer.